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Molekulargenetik
Next Generation Sequencing (NGS)
Digital Droplet Polymerase-Kettenreaktion (ddPCR)
Next Generation Sequencing (NGS)
Untersuchungsmaterial:
mind. 5-10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark oder peripheres Blut. Wichtig: Sollte aus dem gleichen Material eine zytogenetische Analyse gewünscht sein, ist Heparin-Knochenmark bzw. Heparin-Blut das bevorzugte Material.
Analysefrequenz:
1x wöchentlich
Hintergrund & Methodik:
In den letzten Jahren hat die molekulargenetische Diagnostik bei onkologischen Erkrankungen erheblich an Bedeutung gewonnen. Mit der massiv-parallelen Sequenzierung (Next-Generation Sequencing, NGS) können viele Gene (bzw. Hotspotmutationen) auf Sequenzebene kostengünstig gleichzeitig untersucht werden. Der Nachweis molekularer Veränderungen trägt in der Hämato-Onkologie erheblich zur Diagnosesicherung, Prognosebeurteilung, Subtypen-Klassifizierung bzw. zum Nachweis einer minimalen Resterkrankung (MRD) bei.
Anwendungen:
Panel Diagnostik:
Unser verifiziertes Enrichment-Sequencing-Panel (custom-designed; Illumina) umfasst insgesamt ca. 150 relevante Gene, die sowohl bei myeloischen als auch bei lymphatischen Neoplasien von diagnostischer bzw. therapeutischer Bedeutung sind. Die Bearbeitungszeit von der Library Herstellung bis hin zur Daten Analyse beträgt nur wenige Tage. Dabei werden relevante Genabschnitte mit einer hohen Sensitivität von 2-5% Mutationslast sequenziert. Die gewonnenen Sequenzen werden mit einem Referenzgenom abgeglichen und vorhandene Sequenzvarianten mit Hilfe von SNP- bzw. Mutations-Datenbanken analysiert.
IGHV Mutationsstatus:
Lymphatischer Klonalitätsnachweis inkl. sensitiver Klonalitätsnachweis (mind. 10 ml Blut)
Digital Droplet Polymerase-Kettenreaktion (ddPCR)
Untersuchungsmaterial:
mind. 5-10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark oder peripheres Blut. Wichtig: Sollte aus dem gleichen Material eine zytogenetische Analyse gewünscht sein, ist Heparin-Knochenmark bzw. Heparin-Blut das bevorzugte Material.
Analysefrequenz:
3x wöchentlich
Hintergrund & Methodik:
Die Methode der ddPCR basiert auf einer Wasser-Öl Emulsion Technologie, die es ermöglich die PCR-Reaktion in den durch die Emulsion entstandenen Tröpfchen zu kompartimentieren. Eine Probe wird fraktioniert, sodass eine unabhängige PCR-Amplifikation der jeweiligen Moleküle in jedem der entstandenen Tröpfchen stattfindet. Ein passendes Primer-Paar amplifiziert in der PCR-Reaktion die Zielsequenz. Eine mit dem Farbstoff HEX markiert Sonde erkennt die Wildtyp Sequenz, während eine mit dem Farbstoff FAM markierte Sonde die mutierte Sequenz bindet. Nach dem Erkennen der Zielsequenz im Zuge der PCR Reaktion, werden die Sonden durch die DNA-Polymerase abgebaut, wodurch der Quencher (löscht Fluoreszenz vor Bindung der Sonde) gelöst und die Fluoreszenz sichtbar wird. Je nachdem ob Wildtyp oder Mutation vorhanden sind, kann nun pro Tröpfchen ein HEX oder FAM Signal ausgelesen werden. Das Auslesen der Fluoreszenz geschieht in einem Durchlaufverfahren für jedes Tröpfchen einzeln. Aus der Anzahl der FAM-, HEX- und doppelt positiven Signale wird anschließend mithilfe der Poisson-Mathematik auf die ursprünglich im Reaktionsgemisch enthaltenen Kopien und die Mutationslast (Fraktionelle Häufigkeit der mutierten Sequenz) rückgerechnet.
Anwendungen:
Mithilfe der ddPCR gelingt der sensitive und quantitative Nachweis von Punktmutationen aus genomischer DNA.
- JAK2 V617F Mutationsuntersuchung bei myeloproliferativen Neoplasien (MPN)
- BRAF V600E Mutationsuntersuchung bei Haarzellleukämie (HCL)
- MYD88 L265P Mutationsuntersuchung bei Morbus Waldenström bzw. lymphoplasmozytischen Lymphomen (LPL)
- KIT D816V Mutationsuntersuchung bei Mastozytose
- BCR/ABL1 Fusionstranskript (p210) Quantifizierung bei CML (MRD)
Fragmentanalyse
Untersuchungsmaterial:
mind. 5-10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark oder peripheres Blut. Wichtig: Sollte aus dem gleichen Material eine zytogenetische Analyse gewünscht sein, ist Heparin-Knochenmark bzw. Heparin-Blut das bevorzugte Material.
Analysefrequenz:
2x wöchentlich
Hintergrund und Anwendung:
FLT3 (fml tyrosine kinase 3) codiert für eine Tyrosinkinase, die auf der Oberfläche von hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert wird. Eine Mutation des Gens führt dazu, dass die Zellen unkontrolliert proliferieren und somit die Fähigkeit verlieren in reife Blutzellen zu differenzieren. Durch sogenannte Blasten kommt es schließlich zu einer Verdrängung der gesunden Blutbildung. FLT3 kann auf verschiedene Arten mutieret sein, die zwei häufigsten Varianten sind Insertionen in der juxtamembranären Domäne (internal tandem duplications, ITD) oder Punktmutationen im katalytischen Zentrum (tyrosine kinase domain, TKD).
Methodik:
ITD und TKD werden mit fluoreszenz-markierten Primern mittels einer Endpunkt PCR amplifiziert. Anschließend erfolgt ein Restriktionsenzymverdau (EcoRV) für TKD. Die Fragmentanalyse der Amplicons wird mittels Kapillarelektrophorese durchgeführt.